聚酰胺凝胶电泳溶液的研制与操作流程

     聚酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚酰胺凝胶作为支持介质。它在样品介质和聚酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。聚酰胺凝胶是由单体的酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉双酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过酸铵（AP）以及加速剂（TEMED），催化过酸铵产生自由基：以R·代表自由基，M代表酰胺单体，这样由于基”CH2=CH－”一个接一个的聚合作用就形成酰胺长链，同时甲叉双酰胺在不断延长的酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用，所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。酰胺的另一种聚合方法是光聚合，催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照2－3小时即可完成聚合反应。
 操作流程：
1．安装灌胶模具，依照说明书进行
2．按照配方配置一定量（7cm模具配置1mm厚的胶配置5ml）的分离胶溶液和浓缩胶溶液（2ml），过酸铵和TEMED在用前加入。
3．分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具，上方留约1.5-2cm用于加浓缩胶，小心的在分离胶的表面加一层水饱和（或水饱和的、水），封住胶面，以促使聚合并保持胶面平整。
4．室温放置40分钟到1小时后，可以看到一个界面，去掉上层覆盖液，用浓缩胶缓冲液淋洗胶面，然后灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子。
5．静止放置40-60分钟使凝胶聚合，电泳液清洗样品孔。
6．制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1：1混合，与分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min，（7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上样量30ug）
7．加入下槽液，把夹有凝胶的玻板转移到电泳槽，加入上槽液，上样。 
8．连接电源，5-10mA/胶开始电泳，待溴蓝*到达分离胶后加大电流到10-15mA/胶，
9．溴蓝*到达玻璃板底部时停止电泳，取出凝胶，做好标记，准备染色。
10．染色。见考马斯亮蓝染色操作规程及银染色操作规程。
11．扫描。扫描操作见扫描仪的使用说明。
由于聚酰胺凝胶有**的优点，因而四十年来得到广泛的应用，目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有：①可以随意控制胶浓度”T”和交联度”C”，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：10－9 ～10－12 mol/L。③由于聚酰胺凝胶是由－C－C－键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基－CO－NH2 ，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，电泳时不会产生”电渗”。④由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好。⑤透明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存。⑥无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。⑦还可以用作固定化酶的惰性载体。?